2. 在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括:
（1） 固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。
（2）包被抗体(或抗原)的选择：将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时，要求纯度要好，吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响，一般多采用4℃18～24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0和10μg/ml等)进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg/ml。
（3） 酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定(见酶标记抗体部份)。然后再固定其它条件或采取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。
（4） 酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体(如OPD等)有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2在临用前加入。
3. 标本收集：标本收集及保存的好坏，直接决定了实验能否成功。在收集标本之前必须考虑到实验对标本收集及保存的要求，这些要求对标本中待测物质稳定性影响很大。以ELISA为例。ELISA检测的一般是液态标本，应在收集到新鲜标本后立即离心留取上清液1ml左右移入高温灭菌过的1.5ml EP管中。这种标本在4度保存48小时，-20度保存1个月，-80度保存6个月对检测影响不大。样本一般都是怕反复冻融的，这样会使蛋白降解，如需做预实验或需反复取用标本时，应在收集时即分装几个EP管（管外注意用标号笔标记好）。
4. 实验前的准备工作：100μl加样枪及枪头，1000μl加样枪及枪头，100ml量筒（洗净并双蒸水冲洗），500ml量杯（洗净并双蒸水冲洗，实验室没有更小的了），双蒸水100ml（稀释洗涤液用），吹气球，吸水纸（定性滤纸），试管架，避光湿盒，酶标板框，定时器，胶带，剪刀，弃物盒及废液缸；100μl中枪头、1000μl大枪头、1.5ml EP管需事先灭菌好；多次使用的酶标板框应洗净烘干。
5. 准备实验时，预先让37度恒温箱升温至37度；样品和试剂盒在室温下平衡30分钟以上。
6. ELISA试剂盒固化的抗体在底部，加样时枪头千万不要碰到底部；用不完整个试剂盒可以分开用，但分时一定不要摸底部，原因同前。
7. 每次孵育时用胶带封住酶标板口，防止水份蒸发。
8. 微孔板一般是一排8个，在其一端排头的边缘用记号笔标记下顺序（如1，2，3...），以免手工洗板过程中板朝下拍时不慎致微孔板掉出酶标板框而无法确认顺序。
9. 加标准品和样品时每次都要更换一个枪头，避免重复使用枪头而交叉污染。
10. 37度温育后千万不要忘记倒掉微孔板中的液体（包含未结合上的酶联亲和物，其残留必然造成假阳性），并且反复用稀释好的洗涤剂洗板。
11. 应做预实验和标准曲线，如果多数样本测值在最高OD值处波动，要稀释后再重做，然后按稀释倍数算出来最终结果，因为试剂盒是有测试范围的。
